Aunque San Gregorio cumplía fiel y honrosamente sus funciones como prefecto, desde hacía tiempo se sentía llamado a una vocación superior, hasta que por fin resolvió apartarse del mundo y consagrarse al servicio de Dios, siendo ordenado séptimo diácono de la Iglesia Romana y enviado como embajador ante la corte bizantina. A principios del año 586, tras volver a Roma, se convirtió en abad del monasterio de San Andrés.

En el año 590, una terrible epidemia arrebató la vida al Papa Pelagio y el pueblo escogió a Gregorio como nuevo Pontífice. Desde el momento que asumió el cargo de Papa, se impuso el doble deber de catequizar y cumplir con la disciplina; prohibió el cobro injusto de primas por entierros en iglesias, por ordenaciones o por conferir el palio y no permitió a los diáconos dirigir la parte cantada de la misa a menos que fueran escogidos por sus voces más que por su carácter. También destacó como predicador escogiendo temas del Evangelio del día y, hasta nosotros ha llegado algunas de sus homilías, llenas de elocuencia y sentido común, terminadas con una enseñanza moral que podía adaptarse a cada caso. Fue un excelente administrador de la Sede Pontificia pues todos los súbditos estaban contentos con lo que les tocaba en la distribución de bienes y aún entraba dinero a la tesorería.

De toda su labor religiosa en occidente, la conversión de Inglaterra y el éxito que coronó sus esfuerzos encaminados hacia esta dirección fue para él, el mayor triunfo de su vida. Se le reconoce a San Gregorio la compilación del Antiphonario, la revisión y reestructuración del sistema de música sacra, la fundación de la famosa Schola Cantorum de Roma y la composición de varios himnos muy conocidos. Pero su verdadera obra se proyecta en otras direcciones. Se le venera como el cuarto Doctor de la Iglesia Latina, por haber dado una clara expresión a ciertas doctrinas religiosas que aún no habían sido bien definidas y quizá su mayor labor fue el fortalecimiento de la Sede.